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从研发到生产:DuoBioX Explore至Pro系列生物反应器的放大一致性考察

2023. 06. 06
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摘 要


多宁DuoBioXTM 提供从研究型到生产型细胞培养生物反应器,Explore系列台式生物反应器定位于实验室阶段的上游工艺开发、优化和PC研究,规格从500 mL-15 L;Pro系列一次性生物反应器是符合GMP商业化要求的生产型设备,规模从50-2,000 L。


Explore系列是采用了卫星罐分布式布局的台式玻璃生物反应器,具有完全控制功能,能够支持0.6-15 L培养规模。软件采用了先进的SCADA架构,能够实现平行多联培养,数据采集和结果对比分析。


从研发到生产:DuoBioX Explore至Pro系列生物反应器的放大一致性考察

Explore系列平行生物反应器


Pro系列一次性生物反应器采用底部搅拌式罐体设计,可实现从50 L-2,000 L规模生物工艺的连续放大,结合多宁完全自主研发制造的3D一次性细胞培养袋,具有良好的生物相容性优点,其灵活的管路设计,满足各类复杂的上游工艺过程;Pro的搅拌通气一体设计,不仅能提供良好的混匀效果同时又保证了优异的气体传质性能。


从研发到生产:DuoBioX Explore至Pro系列生物反应器的放大一致性考察

Pro系列一次性生物反应器


细胞培养工艺放大一致性-对于工艺开发阶段的台式生物反应器来说,能够为后续的放大提供可靠的过程参数作为放大依据尤为重要,所以通常采用3 L-5 L生物反应器作为建立反应器工艺的开发起点以及持续优化的工具。本试验采用恒定单位体积功耗比(P/V)一致的基本放大原则,对Explore台式3 L规模至Pro 500 L规模的培养工艺一致性进行考察,证明两者之间的具有良好的放大一致性表现。


CHO 细 胞


本试验所采用的细胞株为重组CHO-K1细胞,该细胞表达的产物为一种双特异性抗体。CHO细胞,即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary),它是基因工程蛋白研究中最具有代表性的哺乳动物表达载体,是用来表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞。CHO细胞能够在无血清悬浮培养中以高密度生长,并且在延长的发酵周期中维持高水平的蛋白质表达。


超过70%的蛋白质药物,如单克隆抗体、重组蛋白、疫苗等的首选制造细胞都是CHO细胞。目前我们常用的CHO细胞系有:CHO-K1、CHO-DXB11、CHO-S、CHO-DG44、CHO-GS等。


方 法 与 材 料


培养基

基础培养基:Media C(包括种子培养)

补料培养基:DN feed 2,DN feed B2


细胞株

CHO-K1


生物反应器系统

DuoBioXTM Explore系列平行生物反应器 规格3 L

DuoBioXTM Pro系列一次性生物反应器 规格200 L,500 L


操作方式

批次流加(Fed Batch),初始培养体积一般小于罐体最大工作体积,留出的空间将在后续的培养过程中进行多次间歇性补料,所以培养体积会逐渐增加直至培养结束。细胞接种后会消耗初始培养基中的营养成分(如碳源、氮源)用于生长。随着细胞密度不断增加,罐内营养成分会越来越少,同时代谢副产物不断累积,通过补料可以及时补充细胞所需的营养成分,使细胞密度进一步增加,当代谢副产物累积至细胞生长受到影响,细胞密度和活率也会从高峰开始呈下降趋势。


pH控制

酸调节采用向培养体系中1 mm鼓泡通入CO2气体下调pH值。


碱调节通过蠕动泵向罐内泵入碱溶液如Na2CO3,NaHCO3或NaOH等上调pH值。


通常情况下CHO细胞培养合适的pH环境范围为7.0-7.2。本试验中,罐内pH值通过pH电极在线测量,根据测量值自动反馈调节CO2 质量流量计流速和碱泵转速. pH控制死区设为±0.2,可以有效防止pH调节过冲。


DO控制

通过向罐内内通入不同种类的气体来实现培养体系的溶氧控制。向罐内鼓泡通入Air和O2的方式用来提高DO,而N2可以用来控制DO的下调,实现较低的DO水平甚至无氧环境维持。因氧气在培养基中的溶解度较低,其传质效率受底部通气的比表面积、接触时间影响。大多数哺乳动物细胞生长溶解氧适宜范围通常在20%-60%之间。培养基的溶解氧通过光学DO电极在线监测,根据测量值自动反馈调节MFC-O2 流量。


本试验中Explore台式生物反应器底部Sparger的孔径采用1 mm大泡,桨叶为经典单层三叶式,叶片角度呈45°倾斜,在产生向下的轴向流同时也能降低搅拌对细胞的剪切力。Pro一次性生物反应器培养初期采用1 mm大泡底部通气,通气策略采用大泡和微泡组合方式,当VVM达到0.3后,可开启20 µm底部微泡通气Sparger作为补充。


补料控制

根据Fed Batch操作方式特点,培养过程中需要定时补料,所以补料控制通过Explore台式反应器控制器的Auxiliary模拟4-20 mA输入接口连接外置台秤,Pro自带罐体称重Load Cell,两套系统通过重量控制内置Feed In蠕动泵进行自动补料,补料时间点及频次通过在控制软件中编程预设,自动完成。


参数设定与控制策略-批次流加

工艺条件

Explore-3L

Pro-200L

Pro-500L

培养体积

1L

160L

460L

接种密度

1.5E6 cells/ml

培养时间

16

温度

36.5℃ 第四天降温至33

pH

7.0±0.2

DO

40%

培养基

基础Media C,补料 DN feed 2 & DN feed B2,多宁

补料策略

3% DN feed 2+0.3% DN feed B2 从第三天开始

取样

每天


反应器配置表


I/O

Explore-3L

Pro-200L

Pro-500L

温度电极

Pt-100

pH 电极

化学凝胶电极 梅特勒托利多

DO 电极

光学数字电极 Hamilton

底部通气

1mm大泡,7孔L分布

1mm大泡,2m微泡

1mm大泡,2m微泡

表层通气

转子流量计 0-1000mLPM

MFC-Air

MFC-Air

蠕动泵

4* Watson-Malow 114D

2xWatson Marlow 114D

2xWatson Marlow 313D

2xWatson Marlow 114D

2xWatson Marlow 313D

尾气

半导体冷却(Peltier)

电加热

电加热



罐体

Explore-3L

Pro-200L

Pro-500L

罐体及控温

玻璃,电毯加热

不锈钢水夹套

最大工作体积

2L

200L

500L

最小工作体积

0.6L

40L

100L

桨叶

三斜叶

三斜叶,底搅拌

准数Np

1.5

1.15

罐内高径比

1.5:1

1.6:1

1.5:1

P/V 

28 W/m3


活细胞密度和活率

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细胞代谢和渗透压

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蛋白浓度

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结 论


按照等P/V一致的放大基本原则,对CHO-K1细胞Fed Batch培养工艺顺利实现从3 L台式反应器至200 L和500 L规模一次性生物反应器的工艺放大,细胞生长表现及蛋白产量(>4 g/L) 具有良好一致性表现。


订 购 信 息


培养基产品信息

货号

产品名称

产品规格

M028-001

Media C

1L 液体

MP028-001

Media C

100g 粉末

MP028-010

Media C

1kg 粉末

MP028-100

Media C

10kg 粉末

FT002-1L

DN feed 2

1L 液体

FP002-100g

DN feed 2

100g 粉末

FP002-1kg

DN feed 2

1kg 粉末

FP002-5kg

DN feed 2

5kg 粉末

FT003-300mL

DN feed B2

300mL 液体

FP003-100g

DN feed B2

100g 粉末

FP003-1kg

DN feed B2

1kg 粉末


生物反应器产品信息

货号

产品名称

SDE-00-01-3

Explore 3L生物反应器系统 单罐

SDE-00-04-3

Explore 3L生物反应器系统 四联罐

SDE-00-08-3

Explore 3L生物反应器系统 八联罐

SDP-00-00-0050

Pro-50L   一次性生物反应器

SDP-00-00-0200

Pro-200L  一次性生物反应器

SDP-00-00-0500

Pro-500L  一次性生物反应器

SDP-00-00-1000

Pro-1000L 一次性生物反应器

SDP-00-00-2000

Pro-2000L 一次性生物反应器


*详细产品信息,请联系marketing@duoningbio.com

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